Konfokale Mikroskopie und Spektroskopie mit Raster-Kraft-Mikroskopie
Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB
Kombination aus konfokaler Lasermikroskopie und konfokaler Raman- und Fluoreszenz-Spektroskopie mit Raster-Kraft-Mikroskopie.
Konfokales Prinzip
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- Schematische Darstellung des Prinzips der konfokalen Mikroskopie
Der durch einen Strahlteiler umgelenkte Laserstrahl wird über ein 100-fach Mikroskopobjektiv mit hoher numerischer Apertur (0,95NA) auf die Probe fokussiert. Das von der Probe ausgehende reflektierte, ramanverschobene oder Lumineszenzlicht passiert das Objektiv in umgekehrter Richtung und gelangt über den Strahlteiler und durch eine Lochblende (pinhole) in den Spektrographen oder Detektor (gelber, gerader Strahlengang). Der Anregungsfokus und der Detektionsfokus liegen dabei aufeinander (konfokal).
Für Raman- oder Lumineszenzmessungen muss die Anregungswellenlänge herausgefiltert werden; dies erfolgt durch einen dichroitischen Strahlteiler, der die Laserwellenlänge reflektiert und so nicht in das Detektionssystem gelangen lässt (siehe Abbildung).
Alle Strahlen, die nicht aus dem Fokus kommen, werden durch das Pinhole eliminiert (schwarzer und roter Strahlengang). Dadurch erhöhen sich die Auflösung und der Kontrast sowohl in der xy-Ebene als auch in der z-Richtung. Die Auflösung wird in beiden Fällen durch Rayleigh-Kriterium begrenzt
(Δx,y=0,61 λ/NA, Δz=1,7 λ/NA2).
Zur Erzeugung dreidimensionaler Bilder wird die Probe in allen drei Raumrichtungen abgerastert.
Raman-Spektroskopie
Unter Raman-Spektroskopie versteht man die Untersuchung von inelastisch an intramolekularen oder Gitterschwingungen (Phononen) gestreutem Licht. Die Methode ist nach Ch. Raman benannt, einem der Entdecker des Effektes.
Die Probe wird mit monochromatischem Licht, normalerweise Laserlicht, bestrahlt und das Streulicht wird spektroskopisch analysiert. Man beobachtet dabei neben der Anregungswellenlänge weitere Streulinien, deren Frequenzen ober- und unterhalb liegen. Die Frequenzverschiebungen hängen mit den Schwingungen der Atome oder Atomgruppen innerhalb des Probenkörpers zusammen. Technisch wird bei der Untersuchung des Streulichtes die Anregungswellenlänge herausfiltert, da sie die übrigen Linien an Intensität weit übertrifft.
Die Ramanspektroskopie ergänzt die Infrarotspektroskopie: mit beiden Methoden werden Atomschwingungen registriert, wobei IR-inaktive Schwingungen in jedem Fall ramanaktiv sind.
Durch die Anwendung vom konfokalen Prinzip lassen sich materialcharakteristische Schwingungsbanden dreidimensional mit einer hohen Ortsauflösung abbilden.
Messaparatur
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- Foto des inversen Mikroskops (Olympus IX71)
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- Foto der Messapparatur und schematische Darstellung des Strahlengangs
Firma NT-MDT, NTEGRA-Spektra Nanofinder
- konfokale Untersuchung mit:
- Raman-Spektroskopie
- Fluoreszenz-Spektroskopie
- Laserreflektions-Mikroskopie
- maximale laterale Auflösung: Δx, Δy < 400 nm, Höhenauflösung: Δz < 700 nm
- maximaler Scanbereich 100 µm x 100 µm x 25 µm
- Laseranregung mit:
- 488 nm (Ar-Laser)
- 632,8 nm (HeNe-Laser)
- Möglichkeit zur Messung am inversen Mikroskop (Olympus IX 71) auch in Flüssigkeiten (z.B. Zellkulturmedien)
- Detektion für Fluoreszenz- und Raman-Spektroskopie:
- spektrale Auflösung von 0,025 nm (bei 1200 l/mm Gitter, 10 µm Blende, 520 mm Brennweite)
- Wellenlängenbereich 300 nm - 1100 nm
- Detektion:
- CCD-Kamera für Spektroskopie
- Photomultiplier Tube (PMT) für konfokale Laserreflektion
- Kombination der Spektroskopie mit der Raster-Kraft-Mikroskopie (AFM). Aufnehmen von spektroskopischen und topographischen Bildern auf demselben Probenbereich.
Anforderungen an das Untersuchungsmaterial
- Transparente und nicht transparente Proben der Größe von maximal 5 cm x 5 cm
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