Entwicklung von Enzymen

Enzyme sind aufgrund ihrer definierten Substrat- und Produktspezifität sowie der hohen Chemoselektivität wichtige Biokatalysatoren für die Synthese von Feinchemikalien, Aromastoffen und Pharmazeutika [1]. Die Entwicklung eines Enzyms ist notwendig, wenn eine chemische Reaktion für eine bestimmte industrielle Anwendungen spezifisch und unter milden Prozessbedingungen ablaufen soll.

Für die Entwicklung von Enzymen gibt es zwei wesentliche Schritte, die am Fraunhofer IGB bearbeitet werden. Der erste Schritt beinhaltet die Identifizierung geeigneter Enzyme oder Enzymvarianten in der Natur. Ein zweiter Schritt zielt auf die Verbesserung bekannter Enzyme durch Änderung ihrer Struktur über gerichtete Evolution oder rationalem Design. In der technischen Anwendung sind Stabilität, Aktivität und Substratspezifität eines Enzyms meist von großem Interesse. Dabei spielt vor allem die Enantioselektivität von Enzymen eine große Rolle, um die chirale Reinheit des Reaktionsproduktes zu gewährleisten. Außerdem ist die Löslichkeit von Enzymen nach der Expression ein wichtiges Optimierungsziel, um die Enzym-Ausbeuten in der späteren Aufarbeitung (Down Stream Processing) zu erhöhen.

Eine etablierte Methode für die Identifizierung neuer Enzyme basiert auf dem Screening von Mikrobiotopen. Dabei werden Mikroorganismen aus einem Biotop mit definierten Medien kultiviert, die Nährstofflimitierungen aufweisen und als Substrat meist nur eine Kohlenstoffquelle enthalten. Diese stellt neben der Nährstoffversorgung des Mikroorganismus gleichzeitig auch das Substrat für die gesuchte Enzymreaktion dar. Dadurch können nur Mikroorganismen wachsen, die über das für die Verwertung des Substrates notwendige Enzym verfügen und werden so selektiert. Nach deren Isolation werden die für die Reaktion verantwortlichen Enzyme identifiziert.

Eine Möglichkeit für die Identifizierung von Enzymen in Mikroorganismen ist die Erstellung von Genombanken, einer Vielzahl fragmentierter Genabschnitte aus der DNA isolierter Mikroorganismen, die in geeignete Expressionsvektoren kloniert werden. Aus den Genombanken kann dann über Aktivitäts-Assays der Klon mit entsprechendem Plasmid identifiziert werden, der über die gewünschte Enzymaktivität verfügt. Eine weniger aufwendige Möglichkeit für das Screening nach neuen Biokatalysatoren geht über die Suche nach homologen Sequenzen aus Datenbanken bereits sequenzierter Genomabschnitte [2]. Solche DNA-Sequenzen können aus den Mikroorganismen heraus amplifiziert oder in vitro synthetisiert werden.

Das Fraunhofer IGB führt täglich zahlreiche Transformationen und Rekultivierungen von Mikroorganismen sowie Aktivitäts-Assays von Enzymen durch, um geeignete Enzyme für gewünschte chemische Reaktion zu detektieren.

Das Enzyme Engineering beinhaltet verschiedene molekularbiologische Methoden für die Optimierung von Enzymen. Experimente zum Enzym Engineering werden typischerweise in drei Stufen eingeteilt:

• Diversifizierung: Erstellen von Genbibliotheken mit zahlreichen Varianten eines Enzyms mittels Error-Prone-PCR, DNA-Shuffling oder durch rationales Design
• Screening: Untersuchen der Varianten auf verbesserte katalytische Eigenschaften
• Verifizierung: Vervielfältigung und Auswertung der Gensequenzen verbesserter Biokatalysatoren (DNA-Sequenzierung, Enzym Modellierung)

Ein Werkzeug des Enzyme Engineering ist die gerichtete Evolution. Dabei wird die DNA-Sequenz, die für das Enzym codiert zufällig mutiert (Error-Prone-PCR oder DNA-Shuffling), um eine Vielzahl neuer Enzymvarianten zu generieren. Über geeignete Screening-Assays können aus daraus gezielt Enzymvarianten gefunden werden, die gegenüber dem Wildtyp verbesserte Eigenschaften aufweisen. Der Austausch einiger weniger Aminosäuren in der Enzymsequenz kann bereits sehr große Auswirkungen auf die Wechselwirkungen zwischen Enzym-Untereinheiten und damit der Ausbildung der Quartärstruktur haben, was wiederum sowohl die Flexibilität, als auch die Stabilität des Enzyms beeinflusst.

Am Fraunhofer IGB wurde unter anderem eine thermostabile Oxidoreduktase durch gerichtete Evolution optimiert. Nach Diversifizierung der Gensequenz über Error-Prone-PCR, Screening und Sequenzanalysen wurden in mehreren aufeinander folgenden Zyklen Mutationen gefunden und kombiniert, die die Enzymaktivität um das ca. 50fache steigerten. Die so entwickelten Enzymvarianten wiesen sowohl eine erhöhte spezifische Aktivität, als auch eine verbesserte Affinität zu gewünschten Substraten auf [3].

Neben der gerichteten Evolution existiert der Ansatz des rationalen Designs von Enzymen. Dabei werden durch gezielte Mutationen in der Gensequenz bestimmte Aminosäuren im Enzym ausgetauscht, um verbesserte Eigenschaften des Biokatalysators herbeizuführen. Im Gegensatz zur gerichteten Evolution setzt das rationale Design die genaue Kenntnis der dreidimensionalen Enzymstruktur oder zumindest das Vorhandensein aussagekräftiger Enzym-Modelle voraus.

Das Fraunhofer IGB verfügt zum einen über die Kompetenz der Erstellung computergestützter Enzym-Modelle. Zum anderen können am Fraunhofer IGB mit geeigneter Software auf Basis dieser Enzym-Modelle oder anhand bereits bestehender Kristallstrukturen gezielt Enzymmodifikationen berechnet werden, die zur Verbesserung von biokatalytischen Eigenschaften führen. Beispielsweise wurde anhand eines Modells einer thermostabilen Oxidoreduktase der Einfluss bestimmter Aminosäure-Reste auf die spezifische Aktivität, die Cofaktor-Affinität und die Stabilität des Enzyms analysiert [3].

Um dem häufig enormen Personal- und Zeitaufwand auf der Suche nach geeigneten Biokatalysatoren entgegen zu wirken, wird am Fraunhofer IGB moderne Roboter-Technik für Hochdurchsatzverfahren eingesetzt.

In möglichst kurzer Zeit können dabei eine Vielzahl neuer Enzym-Varianten auf katalytische Funktionalität unter gewünschten Bedingungen getestet werden.

Hierfür stehen dem Institutsteil in Straubing moderne Anlagen zur Verfügung, wie z.B. ein Pipettier-Roboter und eine Picking-Station. Damit können vollautomatisiert bis zu 10 000 verschiedener Enzymvarianten pro Tag untersucht werden.

Das Fraunhofer IGB bietet im Rahmen der Kompetenzen für die Entwicklung von Enzymen folgende Leistungen an:

• Methodenentwicklung
• Enzym Screening
• Molekularbiologische und technische Optimierung von Enzymen und Enzymreaktionen
• Auftragssynthese von Feinchemikalien

1. Hofer, M.; Strittmatter, H.; and Sieber, V. Biocatalytic Synthesis of a Diketobornane as a Building Block for Bifunctional Camphor Derivatives. ChemCatChem, 2013. 5(11): p. 3351-3357.
2. Reiter, J., et al., Enzymatic cleavage of lignin β-O-4 aryl ether bonds via net internal hydrogen transfer. Green Chemistry, 2013. 15(5): p. 1373-1381.
3. Steffler, F.; Guterl, J.-K.; and Sieber, V. Improvement of thermostable aldehyde dehydrogenase by directed evolution for application in Synthetic Cascade Biomanufacturing. Enzyme and Microbial Technology, 2013. 53(5): p. 307-314.