Modellgestützte Verfahrensentwicklung von Bioprozessen

Ausgangssituation

Ziel unserer Arbeiten im Bereich der industriellen Biotechnologie ist es, Bioprozesse mithilfe moderner Messtechnik und mathematischer Modellierung so detailliert wie möglich zu analysieren und zu beschreiben. Dies ermöglicht eine effiziente Prozessoptimierung und Übertragung des Prozesses vom Labor- in den Produktionsmaßstab, da Änderungen im Prozess am Computer vorausberechnet werden und so nur erfolgversprechende Ansätze experimentell validiert werden müssen. Ein solches Vorgehen spart Entwicklungszeit und Kosten und erhöht gleichzeitig das Prozessverständnis. Zusätzlich bieten sogenannte Software-Sensoren weiteres Potenzial zur Kosteneinsparung. Hierbei werden Offline-Prozessparameter wie Biomasse- und Produktkonzentration anhand von Online-Messgrößen, beispielsweise pH-Wert, Abgasdaten oder Verbrauch von Säure oder Base, geschätzt, was die Prozessüberwachung erheblich erleichtert und die Notwendigkeit von Probenahmen senkt.

Vorgehensweise

Screening verschiedener Ethanolproduzenten im Multifermenter.
Screening verschiedener Ethanolproduzenten im Multifermenter.

Grundvoraussetzung für die Maßstabsübertragung (Scale-up) ist ein Versuchssystem, welches der Produktionsanlage in Ausstattung und Geometrie möglichst ähnlich ist. Daher arbeiten wir vorwiegend mit Mini-Bioreaktoren. In Form von Multifermentersystemen erlauben diese ein paralleles Screening verschiedener Stämme und Bedingungen. Durch Auswahl geeigneter Online-Mess- und Regelungstechnik ist es möglich, kritische Fermentationsparameter konstant zu halten und eine Datenbasis für eine mathematische Beschreibung des Produktionsprozesses zu generieren. So ist es uns gelungen, eine Echtzeitmessung flüchtiger Komponenten im Medium anhand eines am Fraunhofer ICT entwickelten Online-Massenspektrometers zu etablieren. Außerdem verfügen wir über Offline-Prozessanalytik, womit Substrat- und Produktkonzentrationen zeitnah bestimmt werden können. Auf Basis dieser Daten wird das Verhalten der Produktionsstämme mathematisch modelliert. Dies beinhaltet die Etablierung von Software-Sensoren bis hin zur mechanistischen Beschreibung der gesamten Fermentation.

Screening von Mikroorganismen

Mikroskopaufnahme intakter (grün) und beschädigter Zellen (rot).
Mikroskopaufnahme intakter (grün) und beschädigter Zellen (rot).

Die Auswahl eines geeigneten Produktionsstammes ist ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklung von Bioprozessen, beispielsweise der Ethanolproduktion aus Lignocellulose. Verschiedene Ethanolproduzenten konnten unter Verwendung der Multifermentersysteme erfolgreich charakterisiert werden. Wichtige Parameter waren hierbei die Ethanolproduktivität und -ausbeute, die Produktselektivität und die Hemmstofftoleranz der einzelnen Mikroorganismen.

Prozessbeobachtung durch Online-Messtechnik

Zellen mit Lipideinlagerung.
Zellen mit Lipideinlagerung.

Das Online-Massenspektrometer konnte bereits für einen enzymkatalytischen Prozess zur gleichzeitigen Konzentrationsbestimmung mehrerer Stoffe in wässriger Lösung eingesetzt werden. Damit konnten Reaktionsverläufe mit einer Empfindlichkeit im unteren ppm-Bereich beobachtet werden. Derzeit wird das Massenspektrometer als Analysegerät in einem biotechnologisch genutzten Druckreaktor implementiert und optimiert, um biotechnologische Verfahren mit gasförmigen Substraten bzw. flüchtigen Produkten untersuchen zu können.

Modellierung und Soft-Sensing

Schätzung der Biomassekonzentration anhand des Baseverbrauchs.
Schätzung der Biomassekonzentration anhand des Baseverbrauchs.
Modellierung der Gibberellinproduktion mit Fusarium fujikuroi.
Modellierung der Gibberellinproduktion mit Fusarium fujikuroi.

Ein Beispiel für die Anwendung von Software-Sensoren und Prozessmodellierung bietet das Gibberellin-Projekt, dessen Ziel die Produktion des Pflanzenhormons Gibberellin mithilfe des Pilzes Fusarium fujikuroi war. Ein generelles Problem bei Pilzfermentationen ist, dass nur ein Teil der gesamten Biomasse metabolisch aktiv ist. Zum einen sterben Hyphen während der Fermentation ab, zum anderen lagert der Pilz Speicherstoffe ein, die die Biomasse erhöhen. Die Konzentration aktiver Biomasse konnte erfolgreich anhand des Basenverbrauchs geschätzt werden. Dies erlaubt schließlich die Berechnung anderer Prozessgrößen, beispielsweise von Substrat- und Produktkonzentrationen, direkt während der Fermentation. Darüber hinaus wurde ein mathematisches Modell auf Basis der Massebilanz und metabolischer Zusammenhänge entwickelt, welches die Biomasse-, Substrat- und Produktkonzentration vorhersagt.Abbildung links zeigt die Verläufe von 19 Fermentationen und die entsprechende Simulation. Man sieht, dass das Modell die Messdaten sehr gut wiedergibt.

Ausblick

Die Kombination aus Parallel-Fermentationstechnik, Online-Mess- und Regelungstechnik und mathematischer Modellierung bildet die Grundlage zum Verständnis eines biotechnologischen Prozesses und ermöglicht somit eine effiziente Prozessoptimierung und -übertragung in den Produktionsmaßstab. Ein solches Vorgehen wird vor allem im Bereich der pharmazeutischen Industrie gefordert. So startete die U.S. Food and Drug Administration 2004 die Initiative Process Analytical Technology, kurz PAT [1]. Die am Fraunhofer IGB durchgeführten Arbeiten zeigen, dass dies auch wegweisend für die weiße Biotechnologie ist.

Literatur

[1] U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration (2004) Guidance for Industry PAT – A Framework for Innovative Pharmaceutical Development, Manufacturing, and Quality Assurance,

Förderung

Wir danken der Allianz Industrie Forschung AiF (eingetragen als Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschungsvereinigungen "Otto von Guericke" e.V.) für die Förderung des Gibberellin-Projekts, IGF-Vorhaben Nr. 16001 N, dem Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst Baden-Württemberg für die Förderung des Projekts DLR@UniST und der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (DBU) für die Gewährung von Promotionsstipendien.

Projektpartner

  • Institut für Biologie und Biotechnologie der Pflanzen, AG Molekularbiologie und Biotechnologie der Pilze, Westfälische Wilhelms-Universität Münster