RIBOLUTION – Identifizierung ncRNA-basierter Diagnostika

Effektive und differenzierte Früherkennung mit molekularer Diagnostik

Beladung der Illumina Hochdurchsatz-Sequenzierplattform für die Sequenzierung.

Unser Gesundheitssystem steht aufgrund der demographischen Entwicklung vor großen Herausforderungen. Mit einer zunehmend älter werdenden Bevölkerung steigt auch die Zahl onkologischer, degenerativer und chronisch entzündlicher Erkrankungen. Die Folge sind steigende Kosten, die unser Gesundheitssystem zunehmend belasten.

Einen Lösungsansatz für dieses Problem bietet eine effektive molekulare Diagnostik. Hier wird die Anwesenheit oder die Konzentration bestimmter Substanzen, sogenannter Biomarker, als Indikator für eine Krankheit oder für das Ansprechen einer bestimmten Therapie genutzt. Durch eine bessere Früherkennung können so schwere und aufwendig zu behandelnde Krankheitsverläufe verhindert werden. Zudem ermöglicht eine verbesserte Differentialdiagnose mithilfe von Biomarkern, Therapien individuell auf den jeweiligen Patienten abzustimmen.

Obwohl der Bedarf in der klinischen Diagnostik sehr hoch ist, fehlen derzeit für sehr viele Erkrankungen solche Indikatoren, die eine ausreichend hohe Spezifität und Sensitivität aufweisen. Ein Beispiel ist die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), die mit über 600 Mio Erkrankungen und über 2,75 Mio Todesfällen pro Jahr weltweit die vierthäufigste Todesursache darstellt. Eine zuverlässige Diagnose wird erst im fortgeschrittenen Stadium durch eine progressive Abnahme der Lungenfunktion gestellt. Für eine Heilung ist es dann meistens zu spät. Ähnlich verhält es sich für das Prostatakarzinom, eine der häufigsten Krebserkrankungen des Mannes. Auch hier fehlen zuverlässige Biomarker, mit denen der Tumor bereits in einer frühen Phase eindeutig diagnostiziert und anschließend behandelt werden kann.

Nicht-kodierende RNAs als Biomarker

Das Ziel des Fraunhofer-Stiftungsprojekts »RIBOLUTION«, in dem neben dem Fraunhofer IGB auch die Institute IZI (Koordination), IPA, FIT, ITEM sowie mehrere klinische Partner (Universitäten Dresden, Leipzig, Charité Berlin) und das Pharmaunternehmen GlaxoSmithKline kooperieren, liegt in der Identifizierung neuartiger diagnostischer Indikatoren für Erkrankungen wie COPD und Prostatakarzinom. Dabei konzentrieren wir uns im Projekt seit Januar 2011 auf eine neue Molekülklasse, die sogenannten nicht-(Protein)-kodierenden Ribonukleinsäuren (ncRNAs), die noch weitgehend uncharakterisiert sind. Bisherige Studien zeigen, dass ncRNAs die zentrale Ebene der zellbiologischen Steuerung in komplexen Organismen darstellen und vielfältige zelluläre Prozesse wie Transkription, Translation, RNA-Editierung, Chromatinstruktur oder epigenetische Prozesse regulieren [1, 2]. Es wird vermutet, dass sie in der Krankheitsentwicklung eine entscheidende Rolle spielen und somit ein besonders hohes diagnostisches Biomarker-Potenzial aufweisen.

Vorgehensweise

Die erste, genomweite Identifizierungsphase neuer, diagnostisch verwertbarer RNA-basierter Biomarker erfolgt am Fraunhofer IGB mithilfe der Hochdurchsatz-Sequenziertechnologie (Next-Generation Sequencing), mit der bis zu 109 DNA-Sequenzfragmente parallel detektiert werden können. Diese hohe Sequenzierdichte erlaubt die Denovo-Identifizierung signifikant auftretender ncRNAs in statistisch ausgewählten COPD- oder Prostatakarzinom-Patientenproben. In der zweiten und dritten Phase des Screening-Prozesses werden diese Ribonukleinsäuren mithilfe spezifischer Sonden auf DNA-Microarrays (Customized Arrays) gefiltert und anschließend mittels quantitativer Echtzeit-PCR an bis zu 2000 Patientenproben validiert.

GeneScapes Viewer

NGS-Daten visualisiert am GeneScapes Viewer: Gene (Pfeile; grau und schwarz), Wiggle-Plot (Kurven; blau).

Ergebnisse

Zur Sequenzierung der ncRNA aus Patientenproben (z. B. aus Vollblut bei COPD) mithilfe der Illumina Hochdurchsatz-Sequenzierplattform HiSeq2000 etablieren wir derzeit geeignete Verfahren zur RNA-Aufbereitung. Ergänzend entwickeln und validieren wir verschiedene Methoden der Probenvorbereitung zur strangspezifischen sowie zur nicht-strangspezifischen Sequenzierung. Alle Verfahren sollen in einer GLP-ähnlichen Umgebung stattfinden, um eine Nachvollziehbarkeit und Dokumentationssicherheit für die spätere Zertifizierung bzw. Zulassung der diagnostischen Marker zu gewährleisten.

Ausblick

Durch den hohen Prozess- und Qualitätskontrollstandard wird sichergestellt, dass valide Biomarker identifiziert werden. Die gesammelten Erkenntnisse aus dem Projekt können dabei auch auf weitere gesellschaftlich relevante Erkrankungen übertragen werden können. Das Projekt wird so einen wichtigen Beitrag für eine »personalisierte Medizin« liefern.

Literatur

[1] Mattick, J. S. (2001) Non-coding RNAs: the architects of eukaryotic complexity. EMBO Rep. 2(11): 986-991

[2] Mattick, J. S.; Makunin, I. V. (2006) Non-coding RNA. Hum Mol Genet. Apr15;15 Spec No 1: R17-29

Projekt- und Kooperationspartner

  • Fraunhofer IZI, Leipzig (Koordinator)
  • Fraunhofer IGB, Stuttgart (Leitung Teilprojekt Biomarker-Screening)
  • Fraunhofer IPA, Stuttgart
  • Fraunhofer FIT, Sankt Augustin
  • Fraunhofer ITEM, Hannover
  • Universitätsklinikum Carl Gustav Carus, Dresden
  • Universität Leipzig
  • Charité Universitätsmedizin Berlin
  • GlaxoSmithKline, London, UK

Förderung

Wir danken der Fraunhofer-Zukunftsstiftung für die Förderung des Projekts »RIBOLUTION – Integrierte Plattform für die Identifizierung und Validierung innovativer RNA-basierter Biomarker für die Personalisierte Medizin«.