FYI-Chip – Nachweis humanpathogener Hefe- und Schimmelpilze im Lab-on-a-Chip

Die Standarddiagnostik von Hefe- und Schimmelpilzinfektionen ist langwierig und fehlerbehaftet. Gefragt ist ein schnelles und zuverlässiges Nachweisverfahren, das relevante Pilz-Erreger und deren eventuell vorhandenen Resistenzen gleichzeitig erfasst. Ziel des Verbundprojekts ist deshalb die Entwicklung eines Objektträger-großen Minilabors (Lab-on-a-chip, LOC) in dem alle Analyseschritte von der Vorbereitung der Probe bis zum Nachweis des Erregers mit Hilfe hochempfindlicher Sensoren innerhalb kürzester Zeit durchgeführt werden können. Dieser diagnostische Chip soll es dem Arzt erlauben, sehr rasch und exakt den Pilz-Erreger und eventuell assoziierte Resistenzen zu identifizieren. Der Patient profitiert von einer frühzeitigen und gezielten Therapie und die Behandlungskosten können deutlich gesenkt werden.

Ausgangssituation

Rhizopus stolonifer

Rhizopus stolonifer, ein gefährlicher Erreger für immunsupprimierte Patienten.

Hefe- und Schimmelpilzinfektionen führen zu schweren Erkrankungen, insbesondere bei immunsupprimierten und Intensiv-Patienten. Bei einer Mortalitätsrate zwischen 30 und 80 Prozent spielt insbesondere der rasche Nachweis des Erregers inklusive seines Resistenzspektrums eine entscheidende Rolle für den Behandlungserfolg. Der klassische Erregernachweis mittels kulturbasierter Methoden (Mikrodilution, Etest) kann für Hefen und Schimmelpilze bis zu 14 Tage in Anspruch nehmen. Außerdem ist aus klinischen Studien bekannt, dass die phänotypische Resistenztestung mit einem Fehler von bis zu 15 Prozent behaftet ist. Oftmals gelingt die Anzucht überhaupt nicht, auch wenn der Patient klinisch eindeutige Symptome aufweist. In diesen Fällen muss eine Verdachtstherapie initiiert werden, die nicht spezifisch auf den Erreger angepasst werden kann.

Aus diesem Grund werden für die Erregeridentifikation vermehrt molekularbiologische Methoden wie Sequenzierung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), PCR oder Real Time quantitative Echtzeit-PCR PCR (qRT q-PCR) eingesetzt. Diese Methoden sind jedoch nur begrenzt multiplexfähig. Das heißt, es kann gleichzeitig nur auf wenige einer Vielzahl im Routinealltag auftretendenr Erreger oder Resistenzen getestet werden (≤10 Parameter). So werden mehrere kostenintensive Tests erforderlich, was den Zeitvorteil der Methode schmälert.

DNA-Microarray als Diagnostik der Wahl

Falschfarbenbild eines DNA-Microarrays

Falschfarbenbild eines DNA-Microarrays

Diese diagnostische Lücke kann durch DNA-Microarrays geschlossen werden, welche die zeitgleiche Untersuchung von bis zu mehreren tausend Parametern erlauben. Bisher werden solche Tests kaum in der Routinediagnostik eingesetzt, unter anderem aufgrund eines hohen experimentellen und apparativen Aufwands zur Prozessierung der Microarrays. Durch den Einsatz von Mikrosystemen, die den gesamten Testablauf in einem sogenannten Lab-on-a-Chip (LOC) vereinen, können diese Probleme minimiert werden.

Ziel: Vollintegriertes Lab-on-a-Chip-System

DNA-Microarray für die Routinediagnostik.

DNA-Microarray für die Routinediagnostik.

Das Fraunhofer IGB und das Institut für Grenzflächenverfahrenstechnik IGVT der Universität Stuttgart entwickeln daher gemeinsam mit Partnern aus der Medizin, Wissenschaft und Industrie im Rahmen des vom BMBF geförderten Forschungsvorhabens »FYI-Chip – Fungi Yeast Identification« ein vollintegriertes Lab-on-a-Chip-System zur schnellen Bestimmung von Hefe- und Schimmelpilzinfektionen in respiratorischen Sekreten und primär sterilen Körperflüssigkeiten bei immunsupprimierten Patienten. Hierfür arbeiten die Wissenschaftler des Fraunhofer IGB und IGVT eng zusammen mit der Lübecker Firma Euroimmun, mit Medizinern des Herz- und Diabeteszentrums Nordrhein-Westfalen sowie mit Entwicklern der Reutlinger Multi Channel Systems MCS GmbH und der Robert Bosch GmbH, Gerlingen. Ziel ist es, die einzelnen funktionalen Komponenten wie die Probenvorbereitung, die Mikrofluidik und die Detektion der Erreger-DNA in einem vollintegrierten LOC zu vereinen.

Ergebnisse

Am IGVT (jetzt IGVP) sind für den Nachweis von bisher über 50 relevanten Hefe- und Schimmelpilzerregern, darunter Candida spp. oder Aspergillus spp., PCR-Systeme und DNA-Sonden entwickelt worden. Zum Nachweis dieser Vielzahl an Erregern wurden PCR-Systeme für mehrere Gene entworfen, die zwischen den Spezies hochkonservierte Bereiche aufweisen, gleichzeitig aber ausreichend variabel sind, um eine Diskriminierung über DNA-Sonden zu erlauben. Diese werden derzeit auf ihre Eignung in LOC-Funktionsmustern geprüft. Am Fraunhofer IGB werden LOC-kompatible Aufschlussverfahren für die Pilzspezies erarbeitet. Die Verwendung von Einmalkartuschen macht das System flexibel und kostengünstig.

Ausblick

Als Mini-Labor verbindet das LOC die Probenvorbereitung direkt auf dem Chip mit der schnellen molekularbiologischen Diagnostik von Hefe- und Schimmelpilzen und deren Resistenzen mit hoher Nachweisempfindlichkeit. Damit kann es den Arzt bei der Diagnosestellung unterstützen und eine zeitnahe, adäquate Therapieeinleitung bzw. Therapieanpassung ermöglichen. Das LOC-System wird so ausgelegt, dass es in nachfolgenden Entwicklungen auf weitere Probenmaterialien, beispielsweise Biopsiematerial oder bakterielle Erreger, sowie auf Antibiotika-Resistenzen angepasst werden kann.

Projektinformationen

Projekttitel

FYI-Chip – Nachweis humanpathogener Hefe- und Schimmelpilze im Lab-on-a-Chip

 

Projektlaufzeit

April 2011 – März 2014

 

Koordinator

  • Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck

 

Kooperationspartner

  • Herz- und Diabeteszentrum NRW, Bad Oeynhausen
  • Institut für Grenzflächenverfahrenstechnik IGVT (jetzt Institut für Grenzflächenverfahrenstechnik und Plasmatechnologie IGVP), Universität Stuttgart
  • Multi Channel Systems MCS GmbH, Reutlingen
  • Robert Bosch GmbH, Gerlingen

Förderung

Wir danken dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) für die Förderung des Projekts »FYI – Fungi Yeast Identification«, Förderkennzeichen 01EZ1113F.