Einführung und Übersicht: Pathogene Pilze als Risiko

Pathogene Pilze als Risiko – Pathogenomics zur Bekämpfung invasiver Pilzinfektionen

Candida albicans ist der häufigste humanpathogene Pilz. Bei gesunden Menschen kann Candida Haut und Schleimhäute befallen – eine eher unangenehme als gefährliche Infektion. Riskanter wird die Infektion bei Patienten, deren Immunsystem geschwächt ist, beispielsweise nach Organtransplantationen oder einer Chemotherapie bei Krebserkrankungen. Bislang gibt es nur wenige Präparate zur Therapie der Candida-Infektion, die zudem erhebliche Nebenwirkungen nach sich ziehen können oder gegen die schon signifikante Resistenzentwicklungen beobachtet wurden.

Aufklärung der Infektionsmechanismen – Zielstrukturen einer antimykotischen Therapie

Hyphen bildende Candida-Zelle

Hyphen bildende Candida-Zelle

Grundlage für die Entwicklung neuer spezifischer Medikamente gegen den Pilz ist die molekulare Charakterisierung des Infektionsvorganges. Proteine, die für die Virulenz des Pilzes von Bedeutung sind, lassen sich durch den Vergleich pathogener und nicht-pathogener Stämme identifizieren.
 Von Bedeutung ist, dass die Virulenz von Candida-Stämmen an die Bildung von Hyphen, fadenförmigen Zellen, mit denen der Pilz in das Wirtsgewebe eindringt, gekoppelt ist. Zudem ist für die Entwicklung neuer fungizider Wirkstoffe das Verständnis der Zellwand des Pilzes von besonderer Bedeutung. Diese in menschlichen Zellen nicht vorkommende Struktur trägt essenzielle Funktionen für die Interaktionen des Pathogens mit dem Wirt und ist damit zentral für dessen Virulenz. Sowohl die Zellwand an sich wie auch die zu ihrem Aufbau und für ihre Anpassung an unterschiedliche Umgebungen notwendigen Faktoren (Adhäsine, Enzyme für den Auf- und Abbau der Zellwand u.v.m.) stellen damit bevorzugte Ziele für antimykotische Substanzen dar.

Targetsuche mittels Proteomanalyse (2-D-Gelelektrophorese)

Der direkte Vergleich des Proteinmusters von pathogenen klinischen Isolaten mit möglichst kongenen nicht pathogenen Stämmen mittels 2-D-Gelelektrophorese zeigt Proteine, die differenziell exprimiert werden und so für die Pathogenität von C. albicans relevant sein können.

Die Zellwand als Target: Oberflächenproteine

Bei humanpathogenen Pilzen wie Candida albicans spielen bestimmte Proteine in der Zellwand, so genannte Adhäsine, eine herausragende Rolle bei der Anheftung der Zelle an das Wirtsgewebe. Die Anheftung ist somit essenziell für die Virulenz des Pilzes. Die Adhäsine sind somit auch potenzielle Targets. In einem anderen Ansatz untersuchen wir gezielt Zelloberflächenproteine, die für die erste Interaktion des Pathogen mit dem Wirt verantwortlich sein können, auf ihren Beitrag zur Pathogenität.

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Zellwandproteomanalysen: Verfahren zur Fragmentierung und Solubilisierung von Zellwandproteinen als Targets

Die Analyse der Adhäsine war bisher schwierig, da sie mit der Zellwand kovalent verknüpft und zudem durch Glykosilierungen stark modifiziert sein können. Ein neuartiges Verfahren hilft, Zellwandproteine zu fragmentieren und zu solubilisieren, um diese qualitativ und quantitativ zu analysieren.

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Transkriptionsprofile mit DNA-Arrays

Parallel dazu wird die Suche nach Virulenzfaktoren auf der Ebene der mRNA durchgeführt. Hierzu ist ein DNA-Microarray erstellt worden, mit dem die bekannten Gene von C. albicans anhand von Transkriptionsprofilen untersucht werden können. Neben genomweiten Arrays (u.a. zum Studium von Wirt-Pathogen-Interaktionen) stehen auch kleinere, themenspezifische Arrays zur Verfügung, z. B. ein Array aller potenziellen Zellwandgene von C. albicans.

Gendeletionsstudien identifizieren Virulenzgene

Auch mit Hilfe von Gendeletionsstudien lassen sich Virulenzgene identifzieren. Mit Hilfe vergleichender Genomanalysen identifizieren und deletieren wir Gene, die Proteine bekannter Signaltransduktionswege, membranständige Sensoren, Transporter oder Transkriptionsfaktoren kodieren.

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Target-Validierung

Um die Proteine als Targets für die Medikamentenentwicklung zu validieren, wurde die Funktion der in den einzelnen Ansätzen gefundenen Proteine weiter charakterisiert.
Für Funktionsstudien werden z. B. die für sie codierenden Gene aus C. albicans entfernt, bzw. überexprimiert. Die Auswirkungen dieser Mutationen werden dann auf die Virulenz der so entstandenen Stämme in unserem 3-D In-vitro-Gewebemodellsystem getestet.

Screeningsystem für die Suche nach antimykotischen Wirkstoffen

Ergänzt werden die Arbeiten zur Aufklärung der Infektionsmechnanismen von Candida durch einen neuen zellbasierten Assay, mit dem Leitstrukturen für Antimykotika schnell und effektiv gescreent werden können. Der Test wurde bereits mit der Substanzbibliothek der emc microcollections, Tübingen, durchgeführt und hat hier eine Reihe interessanter Einzelverbindungen geliefert, die derzeit durch gezielte chemische Modifikation in ihrer Wirkung optimiert werden.