Innozym – Effiziente Herstellung industrierelevanter Enzyme

Enzyme finden bereits breite Anwendung in der Lebensmittel-, der Textil-, der Reinigungs- und Waschmittelindustrie, der Chemie- sowie in der Pharmaindustrie. In der Forschung werden durch moderne Methoden ständig weitere, neue industrierelevante Enzyme entdeckt, wissenschaftlich charakterisiert und hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität optimiert. Es wird geschätzt, dass in der Natur 10 000 Enzyme vorkommen. Davon sind 3000 bekannt, aber nur rund 120 Enzyme werden industriell genutzt [1].

Das Fraunhofer IGB arbeitet daher zusammen mit Partnern aus Forschung und Industrie im Verbundprojekt »Innozym« mit dem Ziel, effiziente, rekombinante Expressionsverfahren zur Produktion technischer Enzyme zu entwickeln und diese bis zu einem Maßstab von 10 m3 herzustellen und aufzureinigen. Das Ziel soll durch die Entwicklung geeigneter Produktionsstämme und durch die Optimierung der Bioprozesstechnik erreicht werden.

Verfahrensentwicklung und -optimierung

Für die Produktion industriell relevanter Hydrolasen und Oxidoreduktasen werden pro- und eukaryotische Expressionssysteme evaluiert und neue Expressionsstämme und Vektoren entwickelt. Für Varianten, die im Labormaßstab zu einer hohen Ausbeute führen, verfolgen wir die Verfahrensentwicklung und -optimierung bis in den Pilotmaßstab (10 m3). Für Untersuchungen zur Maßstabsvergrößerung steht dem Fraunhofer IGB mit dem Fraunhofer-Zentrum für Chemisch-Biotechnologische Prozesse CBP im nächsten Jahr eine integrierte Multifunktionsanlage am Chemiestandort Leuna zur Verfügung, deren Konzeption und Bau ebenfalls Bestandteil des Projekts ist.

Neue Expressionssysteme

Phospholipase-C-katalysierte Hydrolyse von Phospholipiden.
Phospholipase-C-katalysierte Hydrolyse von Phospholipiden.

Gegenwärtig arbeiten wir am Fraunhofer IGB mit wildtypischen und proteasedefizienten Stämmen von Kluyveromyces lactis und Pichia pastoris als eukaryotische Expressionsstämme. Kluyveromyces lactis kann mit verschiedenen Zuckern wie Laktose aus Molkereststoffen kultiviert und induziert werden. Mit Pichia pastoris wird eine methylotrophe Hefe verwendet. Methanol ist preisgünstiger als viele konventionelle Nährmedien und Induktoren und der starke Promotor der Alkoholoxidase I erlaubt eine Produktausbeute an rekombinantem Enzym von bis zu 30 Prozent des Zellproteins. Die verwendeten Stämme eignen sich durch ihre effektiven Sekretionswege insbesondere zur Produktion von Enzymen, die ins Medium abgegeben werden. Sowohl die Produktionskontrolle als auch die Produktaufarbeitung der Enzyme sind hierdurch wesentlich vereinfacht.

Am Fraunhofer IGB entwickeln wir gegenwärtig Produktionsstämme zur Herstellung rekombinanter Hydrolasen wie Phospholipase C und Proteasen sowie Oxidoreduktasen. Im Verlauf des Projekts sollen zusätzlich Produktionsstämme zur Herstellung von Cellulasen, Xylanasen und Lipasen entwickelt werden, die in weiteren Projekten des Fraunhofer IGB und des Fraunhofer CBP Verwendung finden.

Beispiel Phospholipase C

Phospholipase C (PLC) katalysiert die Hydrolyse von Phospholipiden unter Bildung von Diacylglycerolen und wasserlöslichem Phosphorylethanolamin. PLC wird bereits großtechnisch zur Raffinierung von Pflanzenölen eingesetzt, um eine schnellere und nahezu vollkommene Phasentrennung zu erreichen.

Wir verwenden Expressionskassetten mit verschiedenen Varianten synthetischer Strukturgene auf Basis der plc-Sequenz von Bacillus cereus. Die Strukturgene haben wir zudem in Hinblick auf eine optimale Transkription und Translation an die verwendeten Wirtsorganismen angepasst. Die Expressionskassetten werden in die genomische DNA der Expressionsstämme integriert.

Für das Expressionssystem Klyveromyces lactis konnten bereits modifizierte Stämme identifiziert werden, die das entsprechende plc-Konstrukt in mehrfacher Kopienzahl im Genom tragen. Die Enzymaktivität der rekombinanten PLC-Varianten gegen das Substrat p-Nitrophenylphosphorylcholin haben wir mithilfe eines Mikrotiterplatten-basierten Aktivitätstests untersucht. Dabei konnten wir zeigen, dass die optimierten Stämme PLC in aktiver Form ins Kulturmedium sekretieren. Die quantitative Bewertung ist Gegenstand derzeitiger Untersuchungen.

Design des Strukturgens zur Herstellung der Phospholipase C (PLC). Histidin-Reste (His) dienen der Aufreinigung. EcoRI und NotI stellen Schnittstellen für Nucleasen dar.
Design des Strukturgens zur Herstellung der Phospholipase C (PLC). Histidin-Reste (His) dienen der Aufreinigung. EcoRI und NotI stellen Schnittstellen für Nucleasen dar.
Zeitlicher Verlauf der PLC-Expression in K. lactis.
Zeitlicher Verlauf der PLC-Expression in K. lactis.
Aktivität der verschiedenen Phospholipase-C-Konstrukte PLC1, PLC2 und PLC4; malE (maltose binding protein) stellt die Negativkontrolle dar.
Aktivität der verschiedenen Phospholipase-C-Konstrukte PLC1, PLC2 und PLC4; malE (maltose binding protein) stellt die Negativkontrolle dar.

Oxidation einer Modellsubstanz (blau) durch ligninolytische Enzyme.
Oxidation einer Modellsubstanz (blau) durch ligninolytische Enzyme.

Ligninolytische Enzyme aus Pilzen

Im Verbundprojekt »Innozym« beschäftigt sich das Fraunhofer IGB mit der Identifizierung, Charakterisierung und Bereitstellung extrazellulärer, ligninolytischer Enzyme aus bestimmten Ständerpilzen, den sogenannten Weißfäulepilzen. Geeignete Stämme und Kokulturen wurden bereits identifiziert. Die Expression ligninspaltender Enzyme wie Laccasen und Peroxidasen konnte durch unterschiedliche Medienzusammensetzung und Induktoren optimiert werden. Sekretierte Enzyme werden mittels 2-D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Detektion charakterisiert, chromatographisch gereinigt und dann biochemisch untersucht und bewertet. Die Enzyme werden in Submers- bzw. Emerskultursystemen produziert und zellfrei zum enzymatischen Ligninaufschluss, beispielsweise im Rahmen des Verbundvorhabens »Lignocellulose-Bioraffinerie II«, eingesetzt.

Neue ligninolytische Enzyme aus Bakterien

Neben Weißfäulepilzen sind einige xylophage Insekten in der Lage, verholztes Pflanzenmaterial als Nahrungsquelle zu nutzen. Diese Fähigkeit von Termiten und den Larven einiger Käfer- und Schmetterlingsarten ist auf eine symbiontische Lebensweise mit Bakterien und Pilzen zurückzuführen. Im Verbundvorhaben »Lignocellulose-Bioraffinerie II« soll am Fraunhofer IGB in Stuttgart das Spektrum der zur Verfügung stehenden Biokatalysatoren für den Ligninabbau erweitert werden, indem symbiontische Mikroorganismen aus dem Verdauungstrakt von Larven xylophager Insekten angereichert und isoliert werden. Parallel werden kulturunabhängige Verfahren (Metagenomscreening) verwendet, um ligninolytische Enzyme symbiontischen Ursprungs zu identifizieren. Darüber hinaus werden kommerziell erhältliche ligninolytische Bakterienstämme auf ihre Eignung zur Lignin-Depolymerisation untersucht. Geeignete Enzyme werden rekombinant produziert und für zellfreie biotechnische Prozesse herangezogen.

Ausblick

Im Anschluss an die molekularbiologische Stammoptimierung ist geplant, Hochzelldichteverfahren unter Verwendung unterschiedlicher Kohlenstoffquellen in Fed-Batch-Prozessen zu optimieren. Zudem wollen wir die Induktionsstrategien mit dem Ziel einer maximalen Raum-Zeit-Ausbeute am Fraunhofer IGB in Stuttgart und bis zum Pilotmaßstab am Fraunhofer CBP in Leuna evaluieren. Parallel sollen Aufarbeitungsverfahren (Downstream Processing) entwickelt werden, bei denen neben Separationsstechniken zur Biomasse-Abtrennung auch Kristallisations- und Chromatographieverfahren für die Produktreinigung und -konzentrierung im Fokus stehen.

Literatur

[1] Braun, M. et al. (2006) Übersichtsstudie Biokatalyse in der Industriellen Produktion, herausgegeben vom VDI

Projektinformationen

Projekttitel

Innozym – Effiziente Herstellung industrierelevanter Enzyme

 

Projektlaufzeit

März 2009 – Juni 2013

 

Projektpartner

  • Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB, Stuttgart
  • Universität Stuttgart, Institut für Grenzflächenverfahrenstechnik (IGVT), Stuttgart
  • c-LEcta, Leipzig
  • InfraLeuna GmbH, Leuna
  • Linde KCA, Dresden

Förderung

Wir danken dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) für die Förderung des Projekts »Entwicklung innovativer Prozesse zur effizienten Herstellung von Enzymen (Innozym)«, Förderkennzeichen AZ 0315510.