DNA-Microarrays zur Identifizierung von Virulenzfaktoren in Candida ssp.

DNA-Microarrays sind hocheffektive Nachweissysteme für Nukleinsäuren. Mit ihrer Hilfe kann man Expressionsmuster ausgewählter Gene oder ganzer Genome auf einem einzigen Biochip erstellen, aber auch Mutationen erkennen und das Verfahren damit zur Genotypisierung nutzen. Dies spielt z. B. für die Diagnostik von Krankheiten auf DNA-Ebene eine Rolle. Hierbei können durch Hybridisierung die normalen DNA-Sequenzen von veränderten, zu Krankheiten führenden Erbinformationen unterschieden werden. Am Fraunhofer IGB werden seit fast 10 Jahren umfangreiche Erfahrungen für die Herstellung und Entwicklung von Microarrays gesammelt.

Die DNA-Microarraytechnologie wird innerhalb der Abteilung Molekulare Biotechnologie für die Identifizierung von Virulenzfaktoren in Candida ssp. und zur Detektion von Punktmutationen, die zur Resistenz gegen Antimykotika in Candida ssp. führen, etabliert und angewendet.

Die Identifizierung von Virulenzfaktoren wird auf mRNA-Ebene (Transkriptionsprofile) durchgeführt. Candida albicans ist einer der häufigsten Erreger von Pilzinfektionen beim Menschen. Zur Expressionsanalyse (Transkriptom) dieses Pathogens wurden genomweite Arrays mit über 7000 Gensonden entwickelt. Diese sind seit Jahren erfolgreich im Einsatz. In 2009 wurde dieser Array auf den neuesten Stand der Technik gebracht (Bild 1). Dieser Biochip wird für die Identifizierung von Virulenz- und Resistenzfaktoren von C. albicans eingesetzt (Target-Identifizierung). Ziel ist der Nachweis von Faktoren die für die Pathogenität des Pilzes essentiell sind um letztendlich entsprechende Anitmykotika zu entwickeln. Für die Aufklärung von Infektionsmechanismen werden humane Haut- sowie Darmäquivalente verwendet. Diese In-vitro-Testsysteme ermöglichen die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen während einer Infektion oder auch den Test von Wirksubstanzen im Wirtskontext. Entsprechende Arrays für Candida glabrata liegen ebenfalls vor.

Für spezifischere Fragestellungen, wie z. B. die Analyse von Zellwandgenen in C. albicans, wurden Arrays mit reduzierter Sondenzahl entwickelt. Diese umfassen ausschließlich potenzielle Zellwandgene. Mit diesem ca. 120 Gene umfassenden Array wurden Untersuchungen zur Anwendbarkeit bei der transkriptionellen Regulierung von Zellwandgenen beim Übergang von der Hefe- zur Hyphenform, sowie zwischen pathogenen und nicht-pathogenen Stämmen durchgeführt.

Zur Detektion von Mutationen und Polymorphismen im menschlichen Genom (SNP's, Pharmacogenomics) oder zur Identifizierung von Resistenzmechanismen bei pathogenen Mikroorganismen können Oligonukleotid-Arrays auf speziellen Oberflächen mit Enzymreaktionen gekoppelt werden.

Diese basieren auf unterschiedlichen Methoden. Dabei werden, über differenzielle Hybridisierung, APEX (Allelspezifische Primer Extension) oder LDR (Ligations-Detektions-Reaktion), Mutationen in einem Enzym identifiziert, die z. B. zur Resistenz gegen Antimykotika bei C. albicans führen. Diese Arrays sollen der schnellen Erkennung von Resistenzmechanismen dienen [3, 4]. Eine Mitarbeiterin der Abteilung erhielt den Max-Buchner-Preis 2003 für ihre Diplomarbeit zum Nachweis von Punktmutationen in Candida albicans mit einem Resistenz-Chip.

• Max-Buchner-Preis 2003

Die Identifizierung von Virulenzfaktoren wird mittels genomweiter Transkriptionsprofile fortgesetzt. Dabei werden insbesondere Wirt-Pathogen-Interaktionen, die wir mit Hilfe von in-vitro-Testsystemen modellieren können, ins Zentrum unserer Forschungsaktivitäten rücken. Ebenso werden Arrays zur SNP-Detektion und Proteinarrays weiter entwickelt. Ferner entwickeln wir in Zusammenarbeit mit unseren Industriepartnern DNA-Sonden zur Detektion von humanpathogenen Hefen und Schimmelpilzen, die in Routine-tauglichen diagnostischen Lab-On-Chip Systemen eingesetzt werden sollen.

Neben Arrays, die am IGB entwickelt wurden, werden gegenwärtig auch Arrays von kommerziellen Herstellern eingesetzt, beispielsweise für Projekte zur Untersuchung von veränderten Stoffwechselaktivitäten in Escherichia coli Mutanten mittels gesamtgenomischer DNA-Microarrays. Diese Möglichkeit steht für jeden beliebigen Organismus mit bekannter Genomsequenz offen.

[1] Sohn, K., Senyürek, I., Fertey, J., Königsdoefer, A., Joffroy, C., Hauser, N., Zelt, G., Brunner, H., Rupp, S. (2006)
An in vitro assay to study the transcriptional response during adherence of Candida albicans to different human epithelia. FEMS Yeast Research 6: 1085-93

[2] Sohn, K., Urban, C., Brunner, H., Rupp, S. (2003)
EFG1 is a major regulator of cell wall dynamics in Candida albicans as revealed by DNA microarrays. Mol. Microbiol. 47: 89-102

[3] Hauser, N. C., Martinez, R., Jacob, A., Rupp, S., Hoheisel, J. D., Matysiak, S. (2006)
Utilising the left-helical conformation of L-DNA for analysing different marker types on a single universal microarray platform. Nucleic Acid Res. 34: 5101-5111

[4] Hauser, N. C., Zeller, Z., Brunner, H., Tovar, G., Rupp, S. (2004)
Array-Techniken zur Diagnostik von human-pathogenen Pilzen. Mycoses 47/8: 362