Zelluläre In-vitro-Modelle sind in der Infektionsforschung von Nutzen, um molekulare Vorgänge bei Wirt-Pathogen-Interaktionen zu analysieren. Epitheliale Modelle sind dabei besonders geeignet, um die Infektion humanpathogener Organismen nachzubilden.
Wir entwickeln flexible 3-dimensionale Infektionsmodelle, die neben strukturellen Komponenten der menschlichen Haut auch Immunzellen und Reportersysteme für die Aktivierung von Immunsignalwegen beinhalten können.
In der Infektionsforschung sind In-vitro-Modelle ideal dazu geeignet, um initiale Vorgänge bei der Kolonisation von epithelialen Oberflächen durch Pathogene, insbesondere Adhäsions- und Invasionsvorgänge, zu analysieren.
Mit immunkompetenten Modellen können angeborene Immunantworten auf eindringende Pilze (z. B. Candida sp.) und Viren untersucht werden.
Die Modelle setzen wir darüber hinaus ein, um Möglichkeiten zur Modulierung solcher Wirtsreaktionen mithilfe neuer Wirksubstanzen zu identifizieren. Beim Wirkstoffscreening [1] kann gleichzeitig die Wirkung auf die anwesenden humanen Zellen erfasst und so eine erste Einschätzung der toxischen Wirkung der potenziellen Arzneimittel gewonnen werden.
Im Menschen entscheidet vor allem das angeborene Immunsystem, ob es nach der Invasion der Pathogene auch zu einer Infektion kommt. Die angeborenen Abwehrmechanismen gegen Pathogene sind dabei oft stark abhängig von verschiedenen Zelltypen und der 3-dimensionalen Gewebestruktur.
Am Fraunhofer IGB entwickeln wir daher 3D-Infektionsmodelle der Haut, die neben den epithelialen Zellen sowohl strukturelle Bestandteile wie Fibroblasten und Kollagen als auch immunologisch relevante Komponenten wie verschiedene Immunzelltypen enthalten. Solche Modelle werden zur Untersuchung von Mechanismen der Wirt-Pathogen-Interaktion eingesetzt, wobei insbesondere Infektionsvorgänge bei Pilzen (Candida albicans) und Viren (Herpes Simplex Virus, HSV-1) und die Abwehrmechanismen gegen diese Erreger analysiert werden.
Bei Gesunden ist die menschliche Haut resistent gegen symptomatische Infektionen von Mikroorganismen, die wie Candida albicans natürlicherweise die Haut besiedeln. Die eher selten auftretenden Infektionen der Haut sind meist nur oberflächlich. Eine tiefe Invasion in subepitheliale Gewebe, die C. albicans Zugang zum Blutkreislauf ermöglichen und zu einer systemischen Verbreitung führen würde, tritt bei Menschen mit intakter Haut normalerweise nicht auf.
In-vitro-Hautmodelle, die aus Keratinozyten als epidermale und in Kollagen eingebettete Fibroblasten als dermale Schicht bestehen, werden jedoch sehr schnell von C. albicans penetriert und zerstört [2]. Dies ist auch nicht überraschend, da diese Hautmodelle keine Komponenten des Immunsystems besitzen. Aus diesem Grund haben wir reproduzierbar herstellbare Hautmodelle entwickelt, in die zusätzlich Immunzellen integriert wurden. Um die Hautmodelle, unabhängig von spenderbasierten Unterschieden bei Primärzellen, reproduzierbar zu gestalten, haben wir sie aus immortalisierten Keratinozyten und Fibroblasten aufgebaut. Als Immunzellen wurden sogenannte T-Zellen (Thymus-Lymphozyten) in die Modelle integriert, die auch im Menschen der Immunantwort dienen. Die Anwesenheit der T-Zellen führt dazu, dass das Eindringen von C. albicans in das Hautmodell stark reduziert wird und im Beobachtungszeitraum zum Stillstand kommt. Dies bedeutet, dass das System in vitro zumindest über eine teilweise Immunkompetenz verfügt.
Mithilfe von Next-Generation-Sequenzanalysen wurde dieses teilweise immunkompetente Infektionsmodell umfassend in sogenannten Dualen-RNA-Sequenzanalysen in Anwesenheit und Abwesenheit von C. albicans untersucht. Dabei konnten wir feststellen, dass keiner der individuellen Zelltypen für sich alleine eine effektive Abwehr von C. albicans erreichte. Vielmehr ist eine zytokinvermittelte Kommunikation zwischen den verschiedenen Zelltypen notwendig, um eine effektive antimikrobielle Antwort auszulösen. Eines der Schlüsselmoleküle, die wir in diesen Analysen identifizieren konnten, ist der für die Erkennung des Pathogens notwendige Immunrezeptor TLR2. Dieser induziert eine Signalkaskade, die die Pilzinvasion letztendlich zum Stillstand bringt.
1. Burger-Kentischer, A.; Finkelmeier, D.; Keller, P.; Bauer, J.; Eickhoff, H.; Kleymann, G.; Abu Rayyan, W.; Singh, A.; Schroppel, K.; Lemuth, K.; Wiesmuller, K. H.; Rupp, S. (2011) A screening assay based on host-pathogen interaction models identifies a set of novel antifungal benzimidazole derivatives, Antimicrobial agents and chemotherapy 55 (10): 4789-4801. doi:10.1128/AAC.01657-10
2. Dieterich, C.; Schandar, M.; Noll, M.; Johannes, F.J.; Brunner, H.; Graeve, T.; Rupp, S. (2002) In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion, Microbiology 148 (Pt 2): 497-506
3. Burger-Kentischer, A.; Abele, I. S.; Finkelmeier, D.; Wiesmuller, K. H.; Rupp, S. (2010) A new cell-based innate immune receptor assay for the examination of receptor activity, ligand specificity, signalling pathways and the detection of pyrogens, Journal of immunological methods 358 (1-2): 93-103. doi:10.1016/j.jim.2010.03.020
Darüber hinaus werden diese Modelle in Zukunft vermehrt für die Identifizierung und Validierung immunmodulatorischer Substanzen zur Bekämpfung von Infektionen und immunologischen Erkrankungen eingesetzt. Hierfür wurden Reportersysteme für die Aktivierung von Rezeptoren des angeborenen Immunsystems (PRRs) in verschiedene Zelltypen eines 3D-Hautmodells eingebracht. Diese 3D Reporter-Hautmodelle ermöglichen es, die Aktivierung und Hemmung von zentralen Signalwegen des angeborenen Immunsystems im dreidimensionalen Gewebezusammenhang zu messen.
Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB